Chimie Analytique Biologique (Ch3ChAnBio)

Objectifs :

L'analyse des molécules biologiques fait appel à des méthodes spécifiques, abordées dans ce cours : méthodes optiques comme la fluorimétrie, la chromatographie, l'électrophorèse, la centrifugation, la spectrométrie de masse ...    

Compétences :

connaissances scientifiques et rigueur
Capacité de compréhension face à un problème
Capacité d'élaboration d'une réponse à un problème
Capacité de renouveler, enrichir ses connaissances

Prérequis :

Chimie Analytique (2ème année)

Contenu du cours :

1. Préliminaires de structure des biopolymères

Acides á-aminés: structures, symboles, pKa, échange de pont disulfure; Peptides et protéines : notions de conformation ; Description de l'hélice á, feuillet â, â turn ; Forces responsables de la conformation: forces de VdW, paires d'ions, pont H, interaction hydrophobe, additifs augmentant ou diminuant l'interaction hydrophobe ; Quelques modifications post-traductionnelles ; Bases, nucléosides et nucléotides: structure, nomenclature ; Elements de conformation des acides nucléiques

2. Méthodes Optiques

Absorption UV : AA, peptides, protéines ; Dénaturation et spectre UV ; Acides nucléiques, Tm et A260

Fluorescence : Diagrammes de Jablonski et mécanismes de relaxation ; Spectres d'excitation et d'émission ; Effet du solvant ; Réactions de l'état excité ; Rdt quantique et fluorophores; sondes fluorescentes ; Aspects cinétiques et notions de fluorimétrie impulsionelle ; Notions de Polarisation de la fluorescence ; FRET ; Quenching ; applications aux acides aminés, peptides et protéines, acide nucléiques.

ORD et CD : Lumière non polarisée et lumière polarisée dans le plan ; Double réfraction; Polarisation circulaire de la lumière ; Pouvoir rotatoire et nl - nd ; Ellipsité ; Principe de l'appareillage ; Spectres ORD/CD et structure secondaire des protéines ; acides nucléiques.

3. Sédimentation

Principes généraux : Force centrifuge, Poussée d'Archimède, Vitesse stationnaire, Coefficient de sédimentation, Appareillage.

Sédimentation différentielle : Temps nécessaire à la sédimentation, détermination expérimentale de s, Coefficient de sédimentation et MM.

Sédimentation zonale : Description, intérêt, Rôle du gradient de densité

Equilibre de sédimentation : Principe, Détermination de MM

Sédimentation isopycnique : Principe, Marquage isotopique du DNA, Expérience de Meselson - Stahl, Autres sources de différence de densité du DNA.

4. Spectrométrie de Masse

Méthodes d'ionisation de molécules non volatiles : FAB, MALDI, ESI

Analyseurs de masse; MS/MS; LC/MS; Calcul des masses; Applications : peptides, protéines, oligonucléotides

5. Chromatographie

Chromatographie par échange d'ions : phases stationnaires, capacité, titrage des phases stationnaires, le processus d'échange, effet Donnan

Chromato d'affinité, IMAC, chromato covalente,  chromato d'interaction hydrophobe, hydroxyapatite.

GPC : théorie, applications et aspects pratiques.

6. Electrophorèse.

Principes de base.

SDS - PAGE : Support, dénaturation des protéines, détermination des MM, analyse à l'aide de diagramme de Ferguson, gradients de concentration en acrylamide, mise en évidence de fixation anormale de SDS, "Stacking", revelation.

Isoelectric Focussing (IEF) : principe, paramètres expérimentaux, 2D IEF / SDS PAGE

Electrophorèse des acides nucléiques : fragments de DNA, séquençage en gel, PFGE.

Electrophorèse capillaire (CZE) :description, flux d'électroendosmose, MECC, IEF et SDS PAGE.    

Méthode d'enseignement :

Exposés    

Lectures recommandées :

- FREIFELDER, D.

Physical biochemistry, Ed. Freeman

- SCOPES, R.K.

Protein purification : principles and practice, Ed. Springer  Verlag

- SIUZDAK, G.

Mass spectrometry for Biotechnology, Ed. Academic Press, 1996

- SKOOG, D.A., LEARY, J-J.

Instrumental Analysis, Ed. Saunders, 1992

Méthode d'évaluation :

Examen écrit et oral